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隨著鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的實(shí)施，農(nóng)村居民的生活水平顯著提高，洗衣機(jī)、熱水器等家用電器的普及導(dǎo)致農(nóng)村地區(qū)人均日用水量急增?！?020年中央一號(hào)文件》顯示，我國(guó)農(nóng)村地區(qū)每年產(chǎn)生的生活污水高達(dá)90多億噸，由于居民居住分散及地勢(shì)差異，農(nóng)村污水處理設(shè)施建設(shè)難度加大，僅有部分村鎮(zhèn)生活污水得到了集中凈化。未經(jīng)處理的農(nóng)村生活污水含有過(guò)量的病原微生物、有機(jī)污染物和氮磷營(yíng)養(yǎng)元素，這些污染物質(zhì)的直接輸入導(dǎo)致河流湖泊等水體富營(yíng)養(yǎng)化，如藻類大量繁殖、氧氣耗竭、生物多樣性下降和淡水生態(tài)系統(tǒng)的廣泛退化，對(duì)流域水環(huán)境造成巨大壓力。目前，人工濕地、生態(tài)浮島、生態(tài)溝渠等生物生態(tài)工程技術(shù)逐漸成為農(nóng)村污水凈化的有效措施。然而這些方法對(duì)土地需求較高，限制了山地丘陵區(qū)的污水凈化。生物濾池憑借占地面積小、污泥產(chǎn)量低、高營(yíng)養(yǎng)物去除率、易于維護(hù)運(yùn)行等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于丘陵山區(qū)。韓陽(yáng)等對(duì)低山丘陵區(qū)的生物濾池系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)一年的監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明級(jí)聯(lián)生物濾池對(duì)TN、總磷（TP）的平均削減率較高，且污水凈化效果主要與進(jìn)水濃度、溫度、生物量、水力負(fù)荷等相關(guān)。古騰等基于曝氣生物濾池－模塊化人工濕地組合工藝治理農(nóng)村生活污水，結(jié)果表明該組合工藝具有可行性，凈化效率分別為NH3-N（95.29%）、TN（67.65%）、TP（91.42%）出水水質(zhì)可達(dá)GB18918—2002一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)。朱彬等研究不同植物類型條件下生態(tài)濾池的凈化效果，結(jié)果表明菖蒲對(duì)NH3-N（92%）和TP（47%）的去除效果最佳；而風(fēng)車(chē)草與菖蒲組合去除TN（49%）能力最佳。

生物濾池對(duì)污水的凈化充分利用了植物、動(dòng)物、浮游生物和微生物的協(xié)同作用。微生物是其中關(guān)鍵組成部分，通過(guò)生物吸附、生物沉淀、細(xì)胞內(nèi)積累和氧化還原固定等多種機(jī)制消除水體污染物、凈化水質(zhì)。微生物群落與水體環(huán)境具有密切的聯(lián)系，其群落組成能夠反映水體環(huán)境的變化，因此水體微生物信息對(duì)于富營(yíng)養(yǎng)化水體的治理具有重要意義。底泥作為水體污染物的“源”和“匯”，蘊(yùn)含著比水體更為豐富的微生物群落，但是目前針對(duì)污水生態(tài)處理體系微生物群落組成研究較為有限，很多高效脫氮微生物難以得到有效的開(kāi)發(fā)。因此，本研究利用16SrRNA擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)，以四川盆地中部丘陵區(qū)某村鎮(zhèn)建設(shè)的一套無(wú)動(dòng)力級(jí)聯(lián)生物濾池系統(tǒng)為對(duì)象，闡明生物濾池對(duì)村鎮(zhèn)生活污水的凈化效果和不同層級(jí)生物濾池微生物群落結(jié)構(gòu)差異以及主要環(huán)境因子，為明確山區(qū)生物濾池的凈化機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)

1、材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)設(shè)置在四川盆地中部偏北的綿陽(yáng)市鹽亭縣林山鄉(xiāng)中國(guó)科學(xué)院鹽亭紫色土農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站（105o27′24″E，31o16′31″N），實(shí)驗(yàn)所在地區(qū)地形以丘陵為主，海拔400-600m，紫色土分布廣泛，屬中亞熱帶濕潤(rùn)性季風(fēng)氣候，年平均氣溫17.3℃，多年平均降雨量826mm,降雨集中在每年的4-10月。林山鄉(xiāng)面積約1.26hm2，常住人口800人，村鎮(zhèn)分布有少量商鋪和餐館，每天大約產(chǎn)生30-150m3的生活污水。該地區(qū)無(wú)雨污分流系統(tǒng)，污水直接排入溝渠。

1.2 生物濾池

生物濾池（圖1）依據(jù)地勢(shì)沿坡面建設(shè)，由兩棲植物反應(yīng)濾池（1.5m×1.5m×1.5m）和同尺寸的水生植物反應(yīng)濾池從高到低交替銜接，通過(guò)高程差形成自流跌落曝氣通道，配置水陸兩棲植物并形成干濕交替的氧化-還原環(huán)境。生物濾池共6個(gè)梯級(jí)，每個(gè)梯級(jí)設(shè)置3組平行反應(yīng)池，按照污水水流方向依次是B1，B2，……，B6.各生物濾池底部鋪設(shè)厚度為20cm的生物炭、碎石和紫色土母質(zhì)；反應(yīng)池中種植篩選好的、根系發(fā)達(dá)、抗污染和易于成活的水生/兩棲植物，其中兩棲植物反應(yīng)濾池構(gòu)筑中心島，并種植小葉榕，其根系培育為蜂窩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有大面積生物膜附著表面，同時(shí)種植高富集氮磷水生植物（銅錢(qián)草、狐尾藻），水生植物反應(yīng)池內(nèi)種植浮水或沉水植物（銅錢(qián)草、狐尾藻）。

1.3 樣品采集及理化分析

于2019年10月至2020年9月使用干凈的聚乙烯瓶采集生物濾池進(jìn)水、出水樣品，每隔5d采集一次。選擇污水處理效果較好的夏季從B1、B2、B5、B6梯級(jí)濾池（圖1）3個(gè)平行池各采集一份水樣（N=12），每隔5d采集一次，持續(xù)時(shí)間一個(gè)月。用抓斗式采泥器采集B2、B5濾池內(nèi)部左、中、右各采集一份底泥（N=6），放入無(wú)菌聚乙烯自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，存入-20℃的冰箱用于分子生物學(xué)分析。水樣采集完畢立即送到實(shí)驗(yàn)室分析，用0.45μm濾膜過(guò)濾后，使用流動(dòng)分析儀（AutoAnalyzer3；SEAL，Germany）測(cè)定濾液NO3--N、NO2--N、NH4+-N、TDN、DOC、總?cè)芙鈶B(tài)磷（TDP）、正磷酸鹽（PO43--P）濃度；采用堿性過(guò)硫酸鉀紫外分光光度法測(cè)水樣TN濃度；使用鉬酸銨分光光度法測(cè)定水樣TP濃度。

1.4 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

隨機(jī)選擇夏季采集樣品，其中水樣經(jīng)濾膜（0.22μm）抽濾，將濾膜及底泥保存在干冰箱中運(yùn)送至上海派森諾生物科技股份有限公司。使用FastDNASPIN提取試劑盒（MPBiomedicals，SantaAna，CA，USA），提取細(xì)菌基因組DNA，采用NanoDropND-1000分光光譜儀（ThermoFisherScientific，Waltham，MA，USA）和瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)提取的DNA進(jìn)行定量和定性分析。以338F-806R（338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA；806R：CGGACTACHVGGGTWTCTAAT）為引物對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因V3-V4多變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；PCR反應(yīng)參數(shù)如下：熱循環(huán)包括98℃初始變性2min，然后25個(gè)循環(huán)，98℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用AgencourtAMPureBeads（BeckmanCoulter，Indianapolis，IN）純化，并用PicoGreendsDNA檢測(cè)試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）定量。在IllluminaMiSeq平臺(tái)上，利用MiSeq試劑盒v3進(jìn)行了2300bp的雙末端序列測(cè)定。使用QIIMEv1.8.0處理測(cè)序數(shù)據(jù)，將與條形碼精確匹配的原始測(cè)序讀數(shù)分配給各自的樣品并鑒定為有效序列。刪除低質(zhì)量的序列：長(zhǎng)度小于150bp的序列，Phred平均值小于20的序列，含有不明確堿基的序列，以及含有單核苷酸重復(fù)序列大于8bp的序列。剩余的高質(zhì)量序列通過(guò)UCLUST以97%的序列同一性聚類成可操作的分類單元（OTUs）。并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin2019b繪制生物濾池氮磷去除率變化特征圖；采用SPSS21對(duì)不同層級(jí)濾池水體理化性質(zhì)進(jìn)行單因素方差分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后使用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05；使用QIIME和R（v3.2.0）“ggplot2”包進(jìn)行多樣性指數(shù)分析（Shannon、Simpson、Chao1、Observed_species、Faith_pd、Pielou_e）。使用R（v3.2.0）“vegan”包在OTU水平上基于Unweighted_Unifrac距離進(jìn)行非度量多維尺度分析（NMDS）分析以研究不同層級(jí)生物濾池細(xì)菌群落組成差異，同時(shí)使用Adonis分析檢驗(yàn)細(xì)菌群落差異是否顯著；使用PythonLEfSe包及R（v3.2.0）“ggtree”包進(jìn)行差異貢獻(xiàn)分析（lineardiscriminantanalysiseffectsize，LEfSe），篩選不同層級(jí)濾池之間穩(wěn)健的差異物種，即標(biāo)志物種（biomarker）。在派森諾基因云網(wǎng)https://www。genescloud。cn/home進(jìn)行冗余分析（RDA）用于表示細(xì)菌（屬水平）和環(huán)境因子的關(guān)系。使用“psych”包進(jìn)行Spearman相關(guān)分析并且使用“ggplot2”包繪制相關(guān)性氣泡圖。

2、結(jié)果與分析

2.1 生物濾池N、P去除率季節(jié)變化特征

通過(guò)對(duì)生物濾池進(jìn)水、出水連續(xù)一年的監(jiān)測(cè)（圖2），發(fā)現(xiàn)生物濾池對(duì)污染物去除效率呈現(xiàn)季節(jié)波動(dòng)。其中NO3--N、TN、TDN、TP的去除效率在5-8月較高，12-2月較低；對(duì)NH4+-N、NO2--N、TDP和PO43--P的去除率在9-11月較高，12-2月較低。各形態(tài)污染物年平均去除率分別為NO3--N（40.34%）、NO2--N（67.71%）、TN（34.41%）、TDN（35.40%）、NH4+-N（50.83%）；TP（24.80%）、TDP（26.08%）、PO43--P（31.72%）。

2.2 不同層級(jí)生物濾池水體的理化性質(zhì)

選取夏季不同層級(jí)生物濾池的水體進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果如表1所示，不同層級(jí)生物濾池水體的NO2--N、TN、TDN、NH4+-N、DOC存在顯著差異（P<0.05），TP、TDP、PO43--P、NO3--N濃度差異不顯著（P>0.05）；其中第五、六層級(jí)濾池水體DOC、TDN、TN顯著低于第一層級(jí)濾池水體，且第五、六層級(jí)濾池水體NH4+-N、NO2--N顯著低于第一、二層級(jí)濾池水體（P<0.05）。結(jié)果顯示在夏季降雨量增加、污染物濃度偏低情況下，生物濾池對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化元素N凈化效果較P明顯。

2.3 生物濾池水體及底泥細(xì)菌群落組成

采用16SrRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)生物濾池水體和底泥微生物群落組成進(jìn)行分析，根據(jù)97%的相似度水平對(duì)樣本OTUs進(jìn)行聚類，共鑒定出細(xì)菌53個(gè)門(mén)、150綱、364目、656科、1464屬。如圖3A顯示了水體環(huán)境相對(duì)豐度前10的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，包括變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）；優(yōu)勢(shì)菌屬主要包括假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、C39、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、新鞘氨醇單胞菌屬（Novosphingobium）（圖3B）。

底泥（圖3C）優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和放線菌門(mén)（Actinobacteria），且存在與水體細(xì)菌不同的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)如互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes）、嗜熱絲菌門(mén)（Caldiserica）、Spirochaetes。在屬水平上（圖3D），底泥細(xì)菌組成與水體細(xì)菌不同，其優(yōu)勢(shì)菌屬主要為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、水小桿菌屬（Aquabacterium）、綠菌屬（Chlorobium）、Smithella、短波單胞菌屬（Brevundimonas）。

2.4 不同層級(jí)生物濾池水體和底泥細(xì)菌群落差異

不同層級(jí)生物濾池水體及底泥細(xì)菌α多樣性指數(shù)包括Chao1、Shannon、Simpson、Faith_pd指數(shù)和Pielou_E指數(shù)差異均不顯著（P>0.05）。NMDS分析發(fā)現(xiàn)不同層級(jí)生物濾池水體和底泥細(xì)菌群落組成區(qū)分明顯（圖4，Adonis分析，P=0.001），其中第一層級(jí)濾池水體細(xì)菌與其他層級(jí)區(qū)分最為明顯，第五、六層級(jí)水體細(xì)菌群落組成較為相似。

為進(jìn)一步研究不同層級(jí)生物濾池水體微生物群落組成差異，采用LEfSe分析檢測(cè)潛在生物標(biāo)志物（圖5，LDA閾值為2）。不同層級(jí)生物濾池之間共發(fā)現(xiàn)49個(gè)細(xì)菌類群豐度存在顯著差異（P<0.05）。其中第一層級(jí)濾池水體中沒(méi)有顯著的生物標(biāo)志物。第二層級(jí)濾池水體的生物標(biāo)志物類群最多，包括Gamma-proteobacteria綱（發(fā)酵桿菌目Thiotrichales、Competibacterales目、Competibacteraceae科、Candidatus_Competibacter屬、絲硫細(xì)菌科Thiothrix、莢硫菌屬Thiocapsa、Sulfuritalea屬），厚壁菌門(mén)Firmicutes（FamilyXIII科、瘤胃梭菌屬Ruminiclostridium、八疊球菌屬Sarcina、Anaerovorax屬），擬桿菌門(mén)Bacteroidetes（Prolixibacteraceae科、普雷沃菌屬Prevotella_7、Lentimicrobiaceae科），互養(yǎng)菌門(mén)Synergistetes（Syner_01屬），放線菌門(mén)Actinobacteria（博戈里亞湖菌科Bogoriellaceae、放線菌目Actinomycetales、Georgenia屬），WS2門(mén)（WS2綱、WS2目、WS2科、WS2屬），Deltaproteobacteria（NKB15目、NKB15科、NKB15屬）。第五層級(jí)濾池水體生物標(biāo)志物包括髕骨細(xì)菌門(mén)Patescibacteria（Microgenomatia綱、Candidatus_Levybacteria目科屬、WWE3綱目科屬），氨基桿菌屬Aminobacter，疣微菌門(mén)Verrucomicrobia（Rubritaleaceae科、Luteolibacter屬），綠彎菌門(mén)Chloroflexi（暖繩菌目Caldilineales、暖繩菌科Caldilineaceae），浮霉菌綱Planctomycetacia。第六層級(jí)濾池水體的生物標(biāo)志物為Gamma-proteobacteria綱（羅丹諾桿菌科Rhodanobacteraceae、Ellin6067屬、貪噬菌屬Variovorax），疣微菌門(mén)Verrucomicrobia（疣微菌屬Verrucomicrobium），浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）。

2.5 水體細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系

選擇相對(duì)豐度前15的細(xì)菌群落（屬水平）與水環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析，結(jié)果（圖6）顯示，環(huán)境因子共同解釋了細(xì)菌群落差異的48.2%，其中第一軸和第二軸分別解釋了27.74%和16.46%，DOC、TDN、NO2--N、NH4+-N、NO3--N對(duì)微生物群落作用顯著（P<0.05），第一、第二層級(jí)濾池與第五、第六層級(jí)濾池的水體微生物群落被這些顯著的環(huán)境因子區(qū)分開(kāi)。

TDN、DOC、NO2--N、NH4+-N與新鞘脂菌屬Novosphingobium、黃桿菌屬Flavobacterium、噬氫菌屬Hydrogenophaga、氣單胞菌屬Aeromonas、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter顯著正相關(guān)（P<0.05），而與Saccharimonadales、假節(jié)菌屬Pseudarthrobacter、金黃桿菌屬Chryseobacterium、根瘤菌屬Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、羅爾斯通氏菌屬Ralstonia、假單胞菌屬Pseudomonas顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；NO3--N與大部分優(yōu)勢(shì)菌屬負(fù)相關(guān)（P<0.05），與普雷沃菌屬Prevotella_9、假節(jié)菌屬Pseudarthrobacter、Saccharimonadales顯著正相關(guān)（P<0.05）。

2.6 氮轉(zhuǎn)化功能微生物

不同層級(jí)生物濾池對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化元素氮去除能力較磷顯著，為進(jìn)一步探究氮轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物與環(huán)境因子之間的關(guān)系，采用FAPROTAX對(duì)水體細(xì)菌群落功能進(jìn)行注釋，將獲得的15個(gè)氮轉(zhuǎn)化相關(guān)功能類群與水環(huán)境因子進(jìn)行Spearman相關(guān)分析（圖7），結(jié)果顯示好氧氨氧化微生物與水體DOC、TDN、NO2--N、TN顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；好氧亞硝酸鹽氧化微生物、硝化作用微生物與DOC、TDN、NO2--N、TN、NH4+-N顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；硝酸鹽還原微生物與NO3--N顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

3、討論

3.1 生物濾池對(duì)生活污水的凈化效果

生物濾池對(duì)污水氮磷去除率隨著季節(jié)變化，整體表現(xiàn)為春夏秋季去除率高而冬季去除率最低；前人研究也發(fā)現(xiàn)季節(jié)間污染物的去除差異體現(xiàn)在溫度的顯著變化，系統(tǒng)內(nèi)微生物活性受限于溫度，尤其是硝化和反硝化細(xì)菌，對(duì)溫度變化非常敏感，該地區(qū)冬季水溫常低于10℃，在10℃以下時(shí)硝化和反硝化細(xì)菌的代謝和活性趨于下降，脫氮效率受到抑制?？傮w而言生物濾池對(duì)NO3--N（40.34%）、NO2--N（67.71%）、NH4+-N（50.83%）的去除效果較好，且整年脫氮效果相對(duì)磷明顯

3.2 生物濾池水體和底泥細(xì)菌群落組成

生物濾池的穩(wěn)定性是由優(yōu)勢(shì)微生物維持的，在本研究中變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）是各層級(jí)生物濾池水體和底泥樣本的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在細(xì)菌群落中占主導(dǎo)地位。變形菌門(mén)細(xì)菌繁殖速度快，α-Proteobacteria、β-proteobacteria、δ-Proteobacteria和γ-Proteobacteria是富營(yíng)養(yǎng)化環(huán)境中典型的細(xì)菌群落，其中包括豐富的硝化、反硝化、厭氧氨氧化和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌，是有機(jī)物降解和硝化、反硝化等脫氮過(guò)程的主要參與者。先前的研究也表明變形菌門(mén)（Proteobacteria）在農(nóng)村生活污水、淡水、污水處理廠、海洋沉積物、濕地和湖泊沉積物等環(huán)境中占據(jù)主導(dǎo)地位，顯示了其廣泛的分布。陳月芳等研究生物濾池對(duì)農(nóng)村生活污水的凈化也發(fā)現(xiàn)Proteobacteria是最優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，顯示了其廣泛的分布。Wu等對(duì)全球269個(gè)污水處理廠的細(xì)菌群落的全球多樣性研究發(fā)現(xiàn)Proteobacteria占總體細(xì)菌群落82%，展現(xiàn)了其絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。王倩等對(duì)汾河沉積物的研究也表明變形菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)類群。絕大多數(shù)放線菌（Actinobacteria）為好氧或微好氧菌，其下某些屬如分枝桿菌屬（Mycobacterium）具有脫氮功能，還能夠參與有機(jī)物的分解和礦化。擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）是專性厭氧微生物，常用于指示作為水體糞便污染，研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(mén)在生物脫氮的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用；厚壁菌門(mén)（Firmicutes）能在有氧或缺氧的環(huán)境中進(jìn)行代謝，并參與了硝化、反硝化過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)具有生物脫氮功能，這可能是生物濾池對(duì)N污染物消減效率較高的重要因素。本研究中發(fā)現(xiàn)的多個(gè)優(yōu)勢(shì)屬在有機(jī)物降解和脫氮作用中也有報(bào)道：黃桿菌屬（Flavobacterium）是一種常見(jiàn)的異養(yǎng)反硝化菌，常出現(xiàn)在富含硝酸鹽的富營(yíng)養(yǎng)水體中，同時(shí)它在有機(jī)物降解和碳循環(huán)中起著關(guān)鍵作用。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）是一種異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌，具有很好的脫氮性能。新鞘氨醇單胞菌（Novosphingobium）是鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）劃分出來(lái)的新屬，該菌屬?gòu)V泛存在于水體和底泥環(huán)境中，并且大多數(shù)都與有機(jī)污染物如多環(huán)芳烴、β-環(huán)檸檬醛、雌激素等的降解有關(guān)。氣單胞菌屬（Aeromonas）是一類兼性厭氧菌，可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。RDA分析顯示這些優(yōu)勢(shì)菌屬與NO3--N顯著負(fù)相關(guān)，表明硝態(tài)氮濃度顯著影響這些反硝化功能菌。假單胞菌屬（Pseudomonas）是一種異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌，該菌與TDN、DOC、NO2--N、NH4+-N顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明污水的這些污染物含量高可能抑制該菌的繁殖。本研究的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和菌屬在污水脫氮方面發(fā)揮重要的作用。

3.3 生物濾池水體和底泥細(xì)菌群落差異

不同層級(jí)生物濾池水體細(xì)菌群落組成存在顯著差異（NMDS分析，Adonis分析），RDA分析也顯示污水NO2--N、TDN、NH4+-N、DOC對(duì)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著。第一、二層級(jí)生物濾池污水NO2--N、TDN、NH4+-N、DOC濃度偏高，其中第二層級(jí)生物濾池生物標(biāo)志物數(shù)量也較多（圖5），存在多種硝化細(xì)菌，以γ-變形菌Gamma-proteobacteria占優(yōu)勢(shì)，并且也發(fā)現(xiàn)多種放線菌門(mén)（Actinobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes），這類好氧或者兼性脫氮菌主要通過(guò)好氧氨氧化、好氧亞硝酸鹽氧化和硝化作用降解污水DOC、TDN、NO2--N、TN、NH4+-N（圖7）；此外還存在互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes），此類菌的所有菌種均參與了氨基酸的降解過(guò)程中。經(jīng)過(guò)上層生物濾池的凈化，第五、六層級(jí)濾池水體N污染物濃度下降，標(biāo)志性菌種數(shù)量也減少，第五層級(jí)濾池水體典型的生物標(biāo)志物有綠彎菌門(mén)（Chloroflexi），研究表明綠彎菌門(mén)的分布極為廣泛，在普通環(huán)境到極端環(huán)境均有分布，并參與了硝化作用的第二步，即NO2--N的氧化過(guò)程。此外第五、六層級(jí)濾池水體中還共同出現(xiàn)了多種厭氧菌：浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）是典型的厭氧氨氧化細(xì)菌，廣泛存在于淡水水體、污水處理系統(tǒng)等各種厭氧環(huán)境中，其大部分種類對(duì)污水氨氮及亞硝酸鹽有較好的去除作用。疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）是革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛存在于海洋、土壤和人體腸道中，能夠在厭氧條件下進(jìn)行亞硝化作用。第二層級(jí)濾池水體的優(yōu)勢(shì)好氧和兼性脫氮菌與第五、六層級(jí)濾池水體優(yōu)勢(shì)厭氧菌的存在可能是導(dǎo)致上層濾池與末端濾池細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的重要因素，第五、六層級(jí)濾池水體濾池中的多種厭氧菌也加快了污水氨氮和亞硝酸鹽的去除過(guò)程。

底泥和水體細(xì)菌群落存在顯著差異（P=0.001），這與其他人研究一致。底泥作為環(huán)境物質(zhì)和底棲生物的重要載體，不僅富集大量的氮、磷營(yíng)養(yǎng)元素，而且蘊(yùn)含著比水體更豐富的微生物，與上覆水體進(jìn)行著頻繁的能量和物質(zhì)交換，使得底泥成為水體污染的潛在來(lái)源。底泥中的地球化學(xué)元素循環(huán)影響其微生物的多樣性，而底泥中微生物群落的改變又會(huì)影響水生生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)遷移和轉(zhuǎn)化，在一定程度上影響著水體微生物群落結(jié)構(gòu)；同時(shí)，水質(zhì)的變化也會(huì)促使底泥微生物群落發(fā)生改變。因此，底泥和水體微生物群落均是水生生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境變化的重要指標(biāo)，研究底泥與水體微生物群落對(duì)闡明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)和水體凈化具有重要意義。

3.4 生物濾池水體細(xì)菌氮轉(zhuǎn)化功能預(yù)測(cè)

FAPROTAX是目前廣泛運(yùn)用的原核微生物分類的功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)，覆蓋了4600多個(gè)不同的原核微生物，對(duì)環(huán)境樣本中原核微生物的生物化學(xué)循環(huán)過(guò)程（碳、氫、氮、磷、硫等元素循環(huán)）進(jìn)行功能注釋預(yù)測(cè)，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較好。本研究分析結(jié)果顯示生物濾池中污水TN、TDN、NO2--N的去除與好氧氨氧化、好氧亞硝酸鹽氧化、硝化作用顯著相關(guān)（P<0.05），NH4+-N的去除與好氧亞硝酸鹽氧化、硝化作用顯著相關(guān)（P<0.05）。硝化作用由一類化能自養(yǎng)好氧的硝化細(xì)菌完成，氨氧化過(guò)程是硝化過(guò)程的限速步驟，多數(shù)氨氧化細(xì)菌屬于Betaproteobacteria和Gamma-proteobacteria類；亞硝酸鹽氧化作用是硝化反應(yīng)的第二階段，已報(bào)道的歸類于變形菌門(mén)（Proteobacteria）、硝化刺菌門(mén)（Nitrospinae）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）和硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）。本研究中變形菌門(mén)（Proteobacteria）和綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）均是水體和底泥細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（圖3），在好氧氨氧化和亞硝酸鹽氧化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。硝酸鹽還原作用主要在缺氧或者厭氧條件下反硝化菌將NO3--N還原為N2O或N2，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該過(guò)程與NO3--N顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），優(yōu)勢(shì)厭氧/兼性菌如擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）在反硝化過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。生活污水氮素污染主要以氨氮和有機(jī)氮形態(tài)存在，研究也發(fā)現(xiàn)生物濾池的脫氮過(guò)程以好氧硝化反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)（圖7），生物濾池跌落曝氣的設(shè)計(jì)以及水生/兩棲植物的種植利于營(yíng)造好氧狀態(tài)，加快污水TN、TDN、NO2--N、NH4+-N的去除過(guò)程。

4、結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)生物濾池污水凈化的連續(xù)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)生物濾池對(duì)NH4+-N、NO2--N年平均去除率達(dá)到50%以上。這些氮素污染物的去除過(guò)程主要由好氧氨氧化、好氧亞硝酸鹽氧化和硝化作用微生物共同參與，生物濾池內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和菌屬在這些過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。不同層級(jí)生物濾池污水TN、NH4+-N、DOC、TDN、NO2--N差異顯著（P<0.05），同時(shí)層級(jí)間生物濾池微生物β多樣性差異顯著，上層濾池水體（W2）優(yōu)勢(shì)菌以好氧和兼性菌為主，下層濾池水體（W5、W6）存在優(yōu)勢(shì)厭氧菌，這是生物濾池層級(jí)間細(xì)菌群落組成的重要差異，可能與層級(jí)間污水氮素污染物的形態(tài)及濃度變化有關(guān)。研究結(jié)果為深入探討生物濾池脫氮的微生物機(jī)制提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，并可為村鎮(zhèn)生物濾池的構(gòu)建提供微生物信息參考。本研究?jī)H采集第二層和第五層生物濾池的底泥樣品，尚未能開(kāi)展底泥與水體微生物內(nèi)在聯(lián)系的研究，同步研究底泥和水體微生物群落及代謝特征對(duì)揭示生物濾池污水凈化的微生物作用機(jī)制將具有重要價(jià)值。